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Rev Hosp Clín Univ Chile 2021;32:4-16
Claudio Pérez N., Gisselle Escobar A., Pablo Soto B., Camila Ibarra C., Milton Larrondo L., Jorge Alfaro L.
El plasma rico en plaquetas (PRP) es utilizado para facilitar la reparación tisular(1). Funciona como un reservorio de factores de crecimiento y citoquinas que son liberados al momento de activar las plaquetas. En general, un preparado es considerado un PRP cuando la concentración de plaquetas aumenta entre 4 a 10 veces en relación a sangre periférica (150.000 - 400.000 plaquetas /μL)(2). 

Existen diferentes protocolos de obtención de PRP que difieren en los procesos de toma de muestra, centrifugación, métodos de activación, concentración de plaquetas, concentración de leucocitos, contenido de fibrina o fibrinógeno, presencia o ausencia de glóbulos rojos y volumen final obtenido(3-5). Esto ha generado una gran variabilidad en los resultados clínicos(6,7), por lo que se recomienda mencionar el tipo de preparado plaquetario utilizado. En general, la clasificación del PRP se ha enfocado en la concentración de plaquetas y leucocitos presentes en el preparado (Tabla 1); sin embargo, de acuerdo a la clasificación DEPA propuesta por Magalon(8), debe ampliarse esa descripción y considerar: (D) dosis de plaquetas inyectadas, (E) eficiencia en la producción del PRP, (P) pureza del producto y (A) método de activación. 

Nuestro Laboratorio prepara PRP para uso autólogo en problemas de reparación osteomuscular, estético y para el tratamiento del dolor, a diferencia de métodos automatizados como GPS III®, BIOMET®, Plateltex®, Magellan®, Artherx ACP® o BTI®(9,10), la preparación es manual. El objetivo de este artículo es describir las características de nuestra preparación plaquetaria, considerando la clasificación DEPA y compararla a PRPs obtenidos por métodos automatizados utilizados en medicina regenerativa. 

INDIVIDUOS, MATERIALES, MÉTODOS Y PROCEDIMIENTO
Individuos y muestra
Los individuos reclutados firmaron consentimiento informado aprobado por Comité de Ética y certificado por la Oficina de Apoyo a la Investigación Clínica del Hospital Clínico Universidad de Chile (HCUCH). A los individuos se les extrajo en dos ocasiones 30 mL de sangre periférica espaciadas por 10 días en condición de ayuno y sin haber tomado anticoagulantes o antiagregantes plaquetarios en las últimas 72 horas. Las muestras se depositaron en tubos de 10 mL previamente condicionados con 1 mL del anticoagulante ACD-A. 

Preparación de plasma rico en plaquetas
Las muestras fueron sometidas a dos centrifugaciones (centrífuga marca Thermo modelo BR4i multifunction, ángulo fijo): la primera, a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente (TA) para separar las plaquetas de los otros tipos celulares y la segunda, a 2000 x g durante 10 min a TA para reducir volumen plasmático y concentrar las plaquetas. Posteriormente, el preparado se dejó en reposo durante 20 minutos a TA para desagregar las plaquetas. Finalmente se incubó a 22°C en agitación continua hasta su uso. 

Medición de la concentración de plaquetas, leucocitos, eritrocitos y de citoquina TGF-β1 y TGF-β2 en PRPs. 
Se midió en un hemocitómetro (marca Advia, Laboratorio Central, HCUCH) la concentración de plaquetas, leucocitos y eritrocitos en el PRP y en sangre periférica (basal). Para la determinación de las citoquinas, el PRP y el plasma basal fueron activados con 50 μL de CaCl2 10% /mL de solución. Se esperó la formación del coágulo y luego de 40 min se recolectó el exudado plasmático y se realizó la medición con el test Quantikine ELISA Human TGF-β1 y TGF-β2 (R&D, Minneapolis, Minnesota, USA), siguiendo las indicaciones del fabricante. 

Medición de la actividad biológica del PRP sobre células que participan en el proceso de reparación tisular. 
Para evaluar la actividad biológica del PRP in vitro, se desarrollaron tres ensayos.

a. Inducción de fenotipo reparador de macrófagos (M2). Las células se generaron en condiciones establecidas anteriormente(11) y se incubaron con PRP autólogo activado con trombina a una concentración de 50% v/v durante 48 horas (n=3). Posteriormente, las células fueron analizadas por criometría de flujo con los anticuerpos anti-CD14 FITC y anti-CD206-PE-Cγ5. 

b. Proliferación de fibroblastos. 2 x 104 fibroblastos periodontales (cedidos gentilmente por Dr. Patricio Smith, Pontificia Universidad Católica de Chile) fueron incubados a 37°C con 20% v/v de PRP activado con trombina /DMEN (n=9), 10% SFB /DMEN (n=6) o medio DMEN durante 48 h. Posteriormente, se lavó dos veces con suero fisiológico y se agregó DMEN y 20 μL de CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagen, incubando por 2 horas a 37°C. Al final del periodo, se midió la absorbancia a 490 nm en un espectrofotómetro Synergy HT (Biotek) y se calculó el índice de proliferación, dividiendo los valores de Abs de PRP o SFB con respecto a medio DMEN solo. 

c. Crecimiento de células madres mesenquimales (CMM) derivadas de médula ósea. La médula ósea fue obtenida de pacientes (n=2) con patología hematológica de leucemia mieloide crónica (LMC) y que tenían indicación de punción medular para control de su enfermedad. El excedente de muestra se utilizó, previo consentimiento del individuo, para la obtención de CMM. En breve, se disgregó la médula ósea y se agregó 10 mL ACK 1X (Gibco, USA) para eliminar los eritrocitos. Se lavaron las células con PBS y se sembraron 20 x 106 células nucleadas en medio SFB o PRP activado con trombina. A las 48 horas, se eliminó el sobrenadante de cultivo y se agregó medio fresco de RPMI /10% SFB o RPMI /10% PRP. El medio se cambió cada 3 días, contando las células presentes a los 10, 15 y 21 días. Adicionalmente, en el día +21, las células fueron evaluadas por citometría de flujo y se analizó la morfología mediante tinción de hematoxilina/eosina.

Inyección de PRP en paciente con refractura ósea
Se realizó tratamiento con PRP en un paciente hombre de 51 años, quien presentó una refractura de la base del quinto metatarsiano izquierdo de 12 días de evolución. Además, presentó inflamación y dolor al caminar, por lo que cojeaba visiblemente. Para realizar tratamiento se extrajo 27 mL de sangre periférica (concentración plaquetaria basal de 251 x 103 /μL) y luego se preparó el PRP de acuerdo al protocolo descrito. Se obtuvo 2 mL de PRP conteniendo 1842 x 103 plaquetas / μL (total 3,6 x 109 PLT), 1.7 x 103 leucocitos /μL y 0.06 x 106 eritrocitos /μL, la que fue inyectada sin activar al día siguiente. Doce días después se preparó una segunda dosis, también a partir de 27 mL de sangre periférica (concentración plaquetaria basal 330 x 103 /μL), obteniendo 2 mL de producto y conteniendo 2445 x 103 plaquetas /μL (total 4,89 x 109 PLT), 2.4 x 103 /μL y 0.09 x 106 eritrocitos /μL, la que fue inyectada sin activar en el lugar de la lesión. Se realizó cultivo microbiológico en ambos preparados para descartar contaminación. 

Comparación del PRP obtenido en Laboratorio de Terapia Celular con preparados plaquetarios utilizados en medicina regenerativa 
Se comparó el PRP obtenido en nuestro Laboratorio con otras preparaciones descritas para uso clínico. Se compararon los productos según la clasificación DEPA propuesta por Magalon(8) (Tabla 2). Además, se incluyó el anticoagulante utilizado, el estado de activación del producto y el tipo de PRP obtenido de acuerdo a la clasificación establecida por Ehrenfest(4). 

RESULTADOS

Aumento de la concentración de plaquetas y de citoquina TGF-β1 y TGF-β2 en PRPs obtenidos en el Laboratorio de Terapia Celular 

El análisis de datos reveló que el procedimiento aumenta 6,4 ± 1.1 veces la concentración plaquetaria comparado a la concentración en sangre periférica, con un promedio de 1,35 ± 0,33 x 103 PLT / μL (Figuras 1A y 1B). Además, el método es reproducible e independiente del operador que realice la preparación del PRP (Figura 1C). 

Con la técnica empleada se obtuvo un volumen aproximado de 2,5 mL de PRP con una concentración sobre 1 x 106 plaquetas /μL en 17 de 20 preparaciones (85%). Además, el preparado contiene leucocitos (sobre 70% corresponde a linfocitos) en una concentración promedio de 2.76 ± 1.23 células x 103 /μL, pudiendo considerarse como un plasma rico en plaquetas y leucocitos (L-PRP). La contaminación por eritrocitos en el PRP mostró una concentración de 0,102 ± 0,033 x 106 /μL, una reducción de 50 veces la cantidad encontrada en sangre periférica. La pureza del preparado, es decir, el porcentaje de plaquetas con respecto a otros tipos celulares, alcanzó un 92,9%. 

La activación del PRP con CaCl2 provoca la liberación de factores de crecimiento y citoquinas desde las plaquetas hacia el medio. En nuestros preparados, la medición en sobrenadantes plasmáticos luego de 40 minutos postactivación detectó 20.6 ± 6.2 ng /mL de TGF-β1 y de 0.55 ± 0.31 ng/mL de TGF-β2, lo que significa un aumento de 6,5 y 4,2 veces la cantidad encontrada en el suero, respectivamente (Figuras 2A y 2B). Adicionalmente, y al igual que en otros estudios realizados(11-13), confirmamos que existe una relación directamente proporcional entre la concentración plaquetaria y el TGF-β (Figura 2C).

 

El PRP estimula la polarización de macrófagos y la proliferación de células madres mesenquimales (CMM) y fibroblastos in vitro

En este trabajo se evaluó el efecto del PRP sobre células que participan en el proceso de reparación tisular, como macrófagos, CMM y fibroblastos. En nuestros resultados observamos un aumento significativo en la expresión de CD206, un marcador de macrófagos de tipo reparador, en células estimuladas con 50% v/v de PRP activado (Figuras 3A y 3B) o una concentración de 25% v/v (no mostrado). Las concentraciones menores a un 20% v/v de PRP no tienen un efecto sobre la expresión del marcador CD206 en macrófagos; sin embargo, permiten la proliferación de células mesenquimales derivadas de médula ósea (Figura 3D), las que mantienen una morfología alargada (spindle-shaped), filiformes, granulares, con digitaciones de tipo fibroblasto característica de una CMM (Figura 3C) y un fenotipo CD90+ CD105+ CD45- propias de células madres mesenquimales (Figura 3E). El mismo efecto se observó en el cultivo de fibroblastos periodontales, que al ser estimulados con PRP al 20% durante 48 horas, mantienen su morfología típica (Figura 3F) y aumentan significativamente su capacidad (p<0.01) de proliferación comparado a cultivos con 10% SFB (Figura 3G). 

La aplicación de PRP en paciente con refractura ósea favorece la reparación del tejido óseo

Luego de la infiltración de la primera dosis de 3,6 x 109 PLT, el paciente indica que el dolor disminuyó considerablemente, caminando normalmente sin bota ortopédica; sin embargo, la radiografía muestra un leve crecimiento de tejido blando en el lugar de la fractura (Figuras 4A y 4B). Treinta días después de la segunda dosis de 4,89 x 109 PLT, se realiza una segunda radiografía, la que muestra un aumento de la densidad ósea en la zona de fractura (Figura 4C), indicando un proceso de reparación del hueso. En relación a su calidad de vida, el paciente mencionó que mejoró y que volvió a realizar sus actividades normales previas a la fractura ósea. Cabe consignar que en la administración del PRP no hubo complicaciones durante o después de su aplicación en el paciente. 

El PRP obtenido en Laboratorio de Terapia Celular corresponde a tipo BCA de acuerdo a la clasificación DEPA. 
Como mencionamos anteriormente, existen diversos métodos de obtención de PRPs, los cuales originan productos que difieren en su composición plaquetaria, la eficiencia de obtención, pureza, volumen, método de activación, entre otros (Tabla 2). De acuerdo a la clasificación DEPA, nuestro preparado se considera un tipo BCA, es decir, la dosis de PRP inyectada fueron 3,6 y 4,89 x 109 PLT (B), con una eficiencia de recuperación plaquetaria de 53 y 54 % (C) y la pureza fue de 95% (A) en ambas preparaciones. En los productos evaluados no encontramos un PRP con la misma clasificación que el nuestro e incluso notamos que existe una gran diversidad entre las distintas formulaciones. 

La mayoría de protocolos de obtención utilizan ACD-A como anticoagulante en una proporción 1:9 con la sangre extraída del paciente, y a diferencia de EDTA o heparina, mantiene la función plaquetaria. En general, el volumen plasmático obtenido en los preparados plaquetarios ricos en leucocitos (L-PRP), incluido el nuestro, corresponde a un 10% del volumen de la muestra extraída, mientras que en productos plaquetarios pobres en leucocitos (P-PRP) el volumen plasmático está sobre un 30% del volumen inicial. En relación al tiempo de preparación, nuestro procedimiento demora 60 minutos, a diferencia de los PRP automatizados que se obtienen antes de 25 min. Esta diferencia se debe a que nuestro protocolo realiza dos centrifugaciones, sumado al tiempo de incubación empleado para desagregar las plaquetas. En relación al estado de activación del producto, nuestro producto puede ser o no ser activado con CaCl2 antes de ser aplicado, factor que depende exclusivamente del médico a cargo de la administración del producto. 

DISCUSIÓN
En este trabajo se obtuvo un PRP en base a protocolo desarrollado en la Unidad de Terapia Celular del Hospital Clínico Universidad de Chile. La evaluación de sus características de producción y aplicación muestran que la formulación concentra las plaquetas sobre 6 veces con respecto a sangre periférica (Figuras 1A y 1B) y contiene una cantidad de leucocitos residuales que permite identificarlo como un plasma rico en plaquetas y leucocitos (LPRP). Además, presenta una actividad biológica in vitro sobre células que participan en el proceso de reparación tisular (Figura 3), así como también, muestra un efecto en el crecimiento óseo en paciente con refractura ósea (Figura 4). De acuerdo a la clasificación DEPA, nuestro preparado corresponde al tipo BCA y al comparar las características de producción del PRP con otros productos plaquetarios (Tabla 2), se observan diferencias en su composición que podrían generar efectos clínicos distintos. 

En la mayoría de nuestros PRP se obtiene una concentración plaquetaria sobre 1x106 plaquetas /μL, valor estándar que se considera un criterio de calidad en la preparación del producto(14). Este parámetro; sin embargo, no garantiza la actividad biológica deseada, por lo que evaluamos el efecto del PRP sobre diferentes tipos celulares involucrados en la reparación del tejido. Los resultados mostraron que al estimular con 50% v/v de PRP activado con trombina, existe una polarización de macrófagos hacia un fenotipo reparador, un efecto equivalente al conseguido en un estudio anterior(11) al estimular macrófagos con PRP no activado en proporción 1:1000 (dosis de plaquetas 0,3 x 109). Las concentraciones de 20 y 10% de PRP son suficientes para lograr la proliferación de fibroblastos y el crecimiento de CMM, respectivamente, aunque no podemos asegurar que sea la cantidad óptima, ya que no realizamos una curva de dosis-respuesta. En estudios similares, se observa un aumento en la proliferación en fibroblastos periodontales en cultivos, conteniendo un 20% v/v de PRPs obtenido mediante el método de GLO(15) e incluso en concentraciones bajas como al 1% de PRP activados con CaCl2 (16). Del mismo modo, se ha descrito que las concentraciones de PRPs, conteniendo entre 200-1500 x 103 PLT /μL y luego diluidas en soluciones a 10% PRP /medio de cultivo, promueven la proliferación de CMM(17) . De lo anterior se desprende que los efectos biológicos inducidos por el PRPs dependen de su dosis y también del tipo celular a estimular, variables que se suman a las diferencias en el tipo de PRP utilizado y que pueden contribuir a la diversidad de resultados terapéuticos observados(18-20). 

Como hemos mencionado, los componentes varían entre los diferentes tipos de PRPs y actualmente no existe un consenso del contenido ideal de un preparado plaquetario para reparar el tejido. Por ejemplo, a diferencia de preparados considerados puros, nuestro producto contiene leucocitos y puede considerarse un L-PRP. Algunos autores señalan que la presencia de leucocitos genera una actividad antimicrobiana(21) y permite una óptima liberación de factores de crecimiento desde las plaquetas(22), mientras que otros autores sugieren que la inclusión de estas células podría generar efectos negativos, como un aumento de la inflamación o del proceso de fibrosis del tejido(23-24). Tampoco existen datos concretos acerca de la cantidad de factores de crecimiento como BMP-2, FGF, VEGF, EGF o de citoquinas como IL-1 y TGF-β, liberadas desde las plaquetas para la reparación normal sin provocar una fibrosis del tejido. En el caso de TGF-β1, un reconocido agente profibrótico que participa en la regeneración de los tejidos y regulación inmunológica, la concentración en nuestros preparados es menor a otros L-PRP obtenidos por procesos automatizados como GPS III Biomet, Magellan o SmartPrep 2(25), condición que puede deberse al tipo de activador (CaCl2 vs trombina) o a la concentración de leucocitos presentes en el producto(13,25,26). Para zanjar esta discusión, es necesario realizar estudios básico-clínicos que definan la composición y capacidad del PRP en la regeneración apropiada del tejido dañado. En relación a la administración de un preparado plaquetario con y sin activar, nuestro PRP queda supeditado a la decisión del médico tratante. Como antecedente, en un estudio de tratamiento realizado en pacientes con tendinopatía crónica del Aquiles realizado por Hanish(27), se demostró efectos positivos, tanto al administrar un preparado activado (SmartPrep 2, L-PRP), como uno sin activar (Arthrex ACP®, P-PRP). 

Una de las dificultades que ha tenido la aplicación de PRP es que no se ha definido la dosis terapéutica ni la frecuencia necesaria que permita dar una recomendación clínica. En nuestro caso clínico, dos dosis consecutivas de PRP preparadas con nuestro protocolo y conteniendo 3,4 y 4,89 x 109 PLT fueron aplicadas sin activar en un paciente con fractura ósea no consolidada. Se observa que el PRP provoca un aumento de la densidad ósea en el sitio de fractura a los 30 días post segunda dosis, el mismo efecto demostrado para los PRP activados con CaCl2 o trombina autóloga, obtenidos con el método de PRGF system y GPS III, respectivamente(28,29) y aplicados en una sola dosis. De acuerdo a la clasificación DEPA, nuestro preparado corresponde al tipo BCA mientras que las formulaciones de PRGF system y GPS III se clasifican como DCA y CAD, por lo que concluimos que el ordenamiento DEPA sugerido por Magalon(8) permite uniformar y comparar características de preparación de distintos PRPs, pero no define su equivalencia terapéutica. En relación al mecanismo de acción del PRP en la formación ósea observada, ésta podría ser el resultado de la actividad de varios factores de crecimiento contenidos en las plaquetas, como el PDGF, TGF-β, FGF o BMP-2(30,31) y la presencia de fibrina (fibrinógeno) que genera un soporte que favorece la migración y quimiotaxis de células reparadoras de tejido(31). 

Una mejor comprensión del mecanismo de acción de las plaquetas y el diseño de estudios clínicos con nuestro PRP nos permitirá definir su composición ideal para lograr los efectos terapéuticos deseados. En definitiva, creemos que el PRP obtenido en nuestro laboratorio posee las propiedades necesarias para ser una herramienta terapéutica aplicable en nuestro Hospital. 

CONCLUSIONES
Desarrollamos un método de obtención de PRP, el cual permite alcanzar una adecuada concentración plaquetaria en los preparados. 

Las plaquetas contenidas en el PRP liberan TGF-β1 y TGF-β2 luego de su activación, demostrando su funcionalidad. 

El PRP presenta un efecto biológico in vitro sobre células que participan en la reparación del tejido y un efecto en el crecimiento óseo en paciente con refractura ósea. 

Nuestro preparado es similar en componentes a preparados de tipo L-PRP y corresponde a clasificación BCA de acuerdo al sistema DEPA. 

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BQ. Claudio Pérez Núñez

Unidad de Terapia Celular, Banco de Sangre Hospital Clínico Universidad de Chile

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